توضیحات
توانایی جستجوی جهش در ژنوم انسان به منظور یافتن علت بیماری ژنتیکی به توانایی تکنولوژی مورد استفاده برای توالییابی مولکول DNA بستگی دارد. در ابتدا این کار بسیار سخت و پر زحمت بوده است اما امروزه با ظهور تکنولوژیهای جدید محدودیتی در رابطه با توالییابی یک، چندین یا کل ژنهای انسانی وجود ندارد. در اوایل دهه هفتاد میلادی دکتر گیلبرت و سنگر روشهای متفاوتی را برای توالییابی مولکول DNA اختراع کردند. در تکنیک گیلبرت در محل هر یک از چهار نوع نوکلئوتید به طور اختصاصی شکستی ایجاد میشود. مزیت تکنیک سنگر نسبت به روش گیلبرت این است که بر اساس فرآیند همانندسازی DNA است . در این فرآیند یک زنجیره جدیدDNA ، نوکلئوتید به نوکلئوتید با توجه به توالی الگو ساخته میشود. در این تکنیک علاوه بر نوکلئوتیدهای معمولی، نوکلئوتیدهایی که از نظر شیمیایی تغییر یافتهاند ([1]ddNTP ) نیز استفاده میشود . ddNTPها به طور تصادفی وارد فرآیند همانندسازی DNA میشود و به دلیل نداشتن گروه OH موجب توقف فرآیند و جلوگیری از طویل شدن زنجیرهی DNA میشود. در پایان این روش رشتههای DNA با طولهای متفاوتی ایجاد و توسط تکنیک الکتروفورز[2] از یکدیگر جدا میشوند. تکنیک توالییابی سنگر در ابتدا بسیار کارا بود و در حال حاضر دقیقترین و با کیفیتترین روش توالییابی DNA است. روش سنگر بسیار پر هزینه است و در هر واکنش قادر به توالییابی قطعاتی از DNA حداکثر به اندازه 600 جفت باز است. پروژهی ژنوم انسان با استفاده از تکنولوژی توالییابی سنگر در سال 2003 خاتمه یافته است. توالی یابی سنگر به عنوان استاندارد طلایی در نظر گرفته میشود و در آخرین مرحله آنالیز دادههای NGS، واریانت پاتوژن شناسایی شده با توالییابی سنگر تایید میشود. با معرفی نسل نوین توالییابی، تکنیک سنگر به عنوان نسل اول توالییابی شناخته میشود. در حال حاضر بسیاری از تکنولوژیهای NGS از رویکرد سنتز برای توالییابی استفاده میکنند. در این تکنولوژیها نوکلئوتیدها برخلاف روش سنگر خاصیت توقف دهی برگشتپذیری دارند. بنابراین فرآیند سنتز رشته جدید به طور دائمی متوقف نمیشود. در سال 2004 یکی از اولین تکنولوژیهای NGS توسط شرکت 454 Life Sciences ارائه شد که موجب کاهش 6 برابری هزینهی توالییابی در مقایسه با تکنولوژی سنگر شد. این تکنولوژی با روشی به نام پایروسکوئنسینگ[3] قادر به توالییابی با بازدهی بالایی است. در این تکنیک هر یک از چهار نوع نوکلئوتید A، T، C وG با نظم ثابتی وارد واکنش میشوند. در صورتی که نوکلئوتید وارد شده مکمل با نوکلئوتید الگو باشد، مولکول پیروفسفات آزاد شده و پیوند فسفودی استر شکل میگیرد. آنزیمی به نام ATP سولفوریلاز، پیروفسفات را به ATP تبدیل میکند که در مرحله بعد توسط آنزیم لوسیفراز مصرف و موجب تبدیل لوسیفرین به اوکسی لوسیفرین میشود. اوکسی لوسیفرین تولید شده نوری را ساتع میکند که میزان این نور متناسب با تعداد نوکلئوتیدی است که پیوند فسفودی استر ایجاد کرده و در زنجیره قرار گرفته است. با شناسایی نور ساتع شده بعد از هر سیکل اضافه شدن نوکلئوتیدها، توالی DNA الگو به دست میآید. تکنولوژی 454 خوانشهایی با طول 400 تا 500 جفت باز را تولید میکند. تعداد زیادی از تکنولوژیهای NGS مانند: توالییابی ایلومینا، Ion Torrent و Pacific Biosciences همگی با رویکرد سنتز هستند. سیستم SOLiD از تکنولوژی Life از رویکرد لیگاسیون برای توالییابی استفاده میکند. تکنولوژی نانوپور که توسط شرکت هایی مانند Oxford Nanopore Technologies تجاری سازی شده است؛ توالی DNA را از طریق شناسایی تغیرات میدان الکتریکی به دلیل ورود نوکلئوتیدهای مختلف به درون ساختار نانوپور شناسایی میکند.
[1] Dideoxynucleotides
[2] Electrophoresis
[3] pyrosequencing
نقد و بررسیها
هنوز بررسیای ثبت نشده است.