کاوریج در توالی‌یابی NGS

 

مهمترین ویژگی NGS این است که هر باز از DNA چندین بار توالی‌یابی می‌شود. تعداد دفعاتی که یک موقعیت درآزمایش NGS توالی‌یابی می‌شود (به عبارت دیگر تعداد خوانش‌هایی که شامل این موقعیت هستند) کاوریج (عمق توالی‌یابی) نامیده میشود(شکل1). وجود چندین خوانش در یک موقعیت یکسان برای حذف خطاهای توالی‌یابی و مهمتر از آن برای تشخیص هتروزیگوسیتی لازم است.

نکته) برای داشتن یک آزمایش NGS با کیفیت، کاوریج حداقل 10 برای شناسایی هتروزیگوسیتی نیاز است.

نکته) احتمال عدم شناسایی یک واریانت در تمامی خوانشهای یک کروموزوم 1024/1 است.

 

یک از چالشهای مهم NGS در شناسایی واریانتهایی مانند جهش‌های سرطانی، موزائیسم، کایمریسم و هتروپلاسمی DNA میتوکندریایی است که در کمتر از 50 درصد از سلول‌ها وجود داشته باشد. به علت قطعه قطعه شدن تصادفی DNA که در مرحله آماده سازی ( فاز اول) رخ میدهد؛ کاوریج‌های متفاوتی در یک آزمایش NGS به وجود می‌آید. به همین دلیل کاوریج را به صورت میانگین بیان می‌کنند.

نکته) معمولاً درآزمایش NGS مناطقی وجود دارد که کاوریج آنها بسیار بیشتر یا کمتر از میانگین است. یک بیان آگاهانه‌تر برای گزارش میزان کاوریج یک آزمایش NGS، این است که چند درصد از خروجی دستگاه (کل ژنوم، کل اگزوم یا پنل) با کاوریج خاصی (مثل x30) توالی‌یابی شده است. به عنوان مثال در coverage 30x باید هر نوکلئوتید 30 بار توالی یابی شود، در انسان که حدود 3 بیلیون bp وجود دارد در هر ران 90 بیلیون کارکتر پردازش می شود.

به منظور داشتن یک نتیجه مناسب در هنگام شناسایی جهش‌های جرم لاین (جهش‌هایی که انتظار میرود در 50 یا 100 درصد از خوانش‌ها وجود داشته باشد) باید بیش از 80 درصد از ژنوم حداقل 20 بار پوشش داده شده باشد. از دیدگاه اقتصادی مطلوب است که کاوریج مناطق توالی‌یابی شده پیوسته باشد و گسستگی (وجود نواحی با کاوریج بسیار بالا یا بسیارپایین) در آن نباشد. توالییابی با کاوریج بسیار بالا به دلیل افزایش بالای مصرف مواد واکنشگر امری غیرضروری و پر هزینه است. در انتهای این مقاله این نکته را فراموش نکنید که لغات sequencing depth و depth همگی به مفهوم واحد کاوریج دلالت دارند.

نکته) هزینه‌های بالای، اصلی‌ترین عامل محدود کننده محققان برای توالی‌یابی با کاوریج بالا است. بنابراین آزمایش‌های NGS همیشه مصالحه‌ای بین هزینه‌ و کاوریج توالی‌یابی است.

 

شکل 1- کاوریج یا عمق پوشش به معنی تعداد دفعاتی که یک باز توسط خوانش های مختلف پوشش داده شده است. در این شکل بلوک مشکی که نشان داده شده است موقعیت یک باز در پنج خوانش پوشش (5x) داده شده است.

 

محققان به طور معمول برای مشخص کردن سطح کاوریج مورد نیاز خود بر اساس روشی که استفاده می کنند و همچنین عوامل دیگری مانند اندازه ژنوم مرجع ، سطح بیان ژن ، کاربردهای خاص مورد علاقه و مقالات تعیین می کنند. مثال هایی از کاوریج‌های توصیه شده برای روش‌های معمول در جدول زیر ذکر شده است.

 

 

آنالیز کاوریج

آنالیز کاوریج به کاربر نشان می‌دهد که فرآیند encrichment exom چقدر خوب عمل کرده است. آیا رویکرد capture مورد نظر به درستی نواحی مورد نظر را جدا کرده است؟ میانگین کاوریج چه مقدار است؟ قابل توجه است که برای تعیین دقیق ژنوتیپ به حداقل کاوریج مشخصی نیاز است. اگرچه هیچ قانون مطلقی وجود ندارد اما برای فراخوانی واریانت‌های هتروزیگویت نیاز به حداقل کاوریج 20 تا 25 است. مطالعات نشان می‌دهد که اکثر واریانت‌های مرتبط با بیماری در مناطق اگزونی انسان می‌توانند در عمق کلی 120x شناسایی شوند. کاربران باید بدانند که این اعداد بستگی به تکنولوژی مورد استفاده داشته و با پیشرفت روش‌های encrichment تقاضاهای بیشتری در مورد بررسی عملکرد فنی آنها اعمال خواهد شد.