زمان مطالعه:16 دقیقه

 

 

محققان هنوز در انتخاب پنل جداسازی و تکنولوژی توالی‌یابی دچار تردید هستند. در سال‌های قبل رویکردهای انتخاب ژن‌های هدف برای مطالعات ژنتیکی و تشخیصی با استفاده از توالی‌یابی سنگر و SNP genotyping انجام می‌گرفته است. بر خلاف genotyping SNP ، توالی‌یابی کل ژنوم امکان شناسایی جهش‌های نادر را فراهم کرده است (که قبلاً ناشناخته بودند). تکنولوژی نسل نوین توالی‌یابی برتر از توالی‌یابی سنگر است. همچنین برای بررسی بافت‌های توموری که حساسیت بالایی نیازی دارند نیز مناسب است.

به طورکلی، پنل‌های استاندارد موجود (جدول1) دارای مزایای بهتری نسبت به پنل‌های سفارشی هستند. استفاده از پنل‌های استاندارد باعث صرفه جویی در هزینه‌های توالی‌یابی می شود.

 

جدول-1 پنل های استاندارد

 

 

زمانی که پنل‌های جداسازی اختصاصی (به جدول 2) فقط برای چند نمونه استفاده شود بسیار هزینه بردار است. اما در صورتی که این نوع پنل‌ها برای حجم زیادی از نمونه‌ها سفارش داده شود و به طور کامل مصرف شود، این مشکل هزینه ناچیز می‌شود. با توجه به تجربه افرادی که از هر دو نوع پنل استفاده کرده‌اند، بهتر است که پنل‌های استاندارد به طور متوسط کاوریج X100 و پنل‌های اختصاصی کاوریج X400 را ارائه بدهند.

 

جدول-2 پنل های سفارشی

 

 

به عنوان یک جایگزین برای پنل‌های سفارشی ذکر شده در جدول 2، نقاط هدف ممکن است با تکنیک مالتی پلکس پی‌سی‌آر یا پروب‌های وارونگی مولکولی جداسازی شوند. در تکنیک مالتی‌پلکس پی‌سی‌آر بیش از یک جفت پرایمر طراحی می‌شود ولی در پی‌سی‌آر معمولی فقط یک جفت پرایمر وجود دارد. برای اهداف کوچک مانند توالی‌یابی ژنوم میتوکندریایی انسان می‌توان از long-range PCR استفاده کرد.long-range PCR همان PCR معمولی است ولی با این تفاوت که آنزیمی که استفاده می‌شود دارای بازدهی بالا بوده و تا چندین کیلو جفت باز را می‌تواند تکثیر کند.

 

 

 

انواع رویکردهای جداسازی

رویکرد مبتنی بر PCR

رویکردهای مبتنی بر PCR برای اهداف کوچک با اندازه تقریبی 10 تا 100 کیلوباز ایده آل هستند. پنل‌های بر اساس PCR ، شامل یک پرایمر ( به طورکاملاً اختصاصی طراحی شده ) و مواد واکنش PCR ( شامل نوکلئوتیدها و آنزیم‌ها و بافر باشد) است. واکنش PCR می‌تواند به صورت یکی از تکنیک‌های Simple multiplex PCR، Micro-droplet PCR و یا براساس Array باشد.

مزایا

هر سه تکنیک گفته شده عملکرد بالایی دارند و همچنین نتایج خوبی با مواد formalin-fixed و paraffin ( این مواد برای فیکس کردن بافت سرطانی به منظور نگهداری طولانی مدت آن استفاده می‌ شود) دارد.

معایب

وجود SNP در محل اتصال پرایمر، موجب عدم اتصال آن‌ها به جایگاه مخصوص خود می‌شود و بنابراین آمپلیکون‌ها از دست می‌روند. جهش‌های ساختاری فقط از طریق وجود کاوریج بالا قابل شناسایی هستند.

 

 

رویکرد مبتنی بر Oligo hybridization

برای اهداف بین 100 تا 500 کیلوباز، چند روش مشابه مانند Haloplex (Agilent)، TruSeq Amplicon (Illumina) و MIPs وجود دارد. این روش‌ها از هیبریداسیون Oligo خاص برای شناسایی target استفاده می‌کنند (بدون اینکه PCR استفاده شود(.

مزایا

این رویکرد نتایج و عملکرد مناسبی با مواد FFPE دارد و همچنین دارای اختصاصیت بالا و مقرون به صرفه است.

معایب

وجود SNP در محل اتصال پرایمر، موجب عدم اتصال آن‌ها به جایگاه مخصوص خود می‌شود و بنابراین آمپلیکون‌ها از دست می‌روند. جهش‌های ساختاری فقط از طریق کاوریج بالا قابل شناسایی هستند.

 

 

رویکرد مبتنی بر classical hybridization

برای اهداف حدود 500 کیلوباز تا کل اگزون‌ها، روش classical hybridization استفاده می‌شود.

مزایا

جهش‌های ساختاری با exonic breakpoint می‌تواند شناسایی شوند.

معایب

این رویکرد نیاز به نمونه‌ای با کیفیت و حجم بالا دارد. اما این رویکرد برای استفاده از مواد FFPE محدودیت دارد. طبق مقالات معتبر انتخاب پروتکل‌های Truseq و SureSelect برای کار با مواد FFPE مطلوب است.

 

 

 

استراتژی انتخاب نوع دستگاه توالی‌یابی و محصول جداسازی (پنل)

بعضی از محصولات جداسازی به طور اختصاصی برای یک دستگاه توالی‌یابی تولید شده است و این دستگاه‌ها دارای بازده‌های مختلفی هستند (شکل1). بنابراین انتخاب محصول جداسازی باید با‌توجه‌ به تعداد نمونه (که قرار است مورد توالی‌یابی قرار بگیرد) باشد(جدول 3). به طور مثال استفاده از پنل‌های ION Ampliseq برای پروژهای کوچک و کم بازده مناسب است و به طور اختصاصی برای دستگاه Ion PGM طراحی شده است.

 

 

جدول-3 توالی‌یابی‌های رومیزی(Benchtop)

 

کیت جداسازی شرکت کیاژن حداکثر می‌تواند 12 نمونه مختلف را در هر فلوسل مالتی پلکس کند. اما در حالی که در کیت‌‌های سایر شرکت‌ها حداقل می‌تواند 96 ایندکس مختلف داشته باشند. نکته دیگر در انتخاب پنل، مقدار DNA ورودی و کیفیت آن است. به عنوان مثال کیت Nextra(Illumina)نیاز به 50 نانو گرم DNA دارد؛ در حالی که در تکنیک‌هایی که بر اساس هیبریدیزاسیون است، نیاز به 1 تا 3 میکروگرم DNA است.

بعضی دیگر از محصولات جداسازی نیاز به تجهیزات آزمایشگاهی اضافی (مانندIllumina’s TruSeq Custom Amplicon) یا حتی دستگاه‌های گران قیمتی مانند RainDance یا fluidigm دارند. بدون شک، برای توالی‌یابی تارگت‌های با سایز بزرگ و با نمونه‌های بالا نیاز به دستگاه پربازده است. بنابراین، مقرون به صرفه‌ترین راه برای توالی‌یابی این نوع نمونه‌ها استفاده از دستگاهی مانند HiSeq است. به عنوان مثال دستگاه GS Junior از شرکت Roshe و دستگاه Ion PGM از شرکت Life technology برای بررسی یک بیمار مناسب است. در حالی که برای مطالعات کوهورت از نظر اقتصادی به صرفه است که از دستگاه‌های Miseq و QIAGEN GeneReader استفاده شود. وقتی یک دستگاه امروزه کم بازده است این بدین معنی نیست که برای همیشه ثابت است. چرا؟ چون تکنولوژی‌ها به سرعت در حال پیشرفت و بهبود دستگاه‌ها مستمر است. به عنوان مثال شرکت ایلومینا اعلام کرده است که یک سیستم Miseq با بازدهی بالا ساخته است.

چندین پنل جداسازی اختصاصی برای انواع بیماری‌ها ایجاد شده است که می‌تواند به خوبی جهش‌ها را با هزینه و زمان کمتری شناسایی کند(جدول4). در بیماران سرطانی بعد از برداشت بافت مورد نظر، آن را با پارافین فیکس می‌کنند تا تغییری در بافت آن رخ ندهد. ولی اینکار به مرور زمان باعث خورد شدن DNA می‌شود، بنابراین برای توالی‌یابی این نوع نمونه‌ها تکنولوژی NGS مناسب است.

 

 

جدول-4 نمونه هایی از پنل‌های سفارشی که برای انواع بیماری های ایجاد شده است

 

بررسی تغییرات ژنومی مرتبط با بیماری فرد، قبل و در طول درمان مهم است. با استفاده از شناسایی این تغییرات، تعداد درمان‌های هدفمند به سرعت افزایش یافته است. نتایج مطالعات توالی‌یابی نشان می‌دهد که حداقل کاوریج X177 برای شناسایی قابل اعتماد ترانسلوکاسیون‌های کروموزومی (translocation) و کاوریج X150 برای شناسایی تغییرات تک نوکلئوتیدی و ایندل‌ها لازم است.

 

شکل 1 -درخت تصمیم برای انتخاب محصول جداسازی و نوع دستگاه نوالی‌یابی-درخت تصمیم با مقدار سایز هدف برای توالی‌یابی شروع می‌شود(رنگ خاکستری)،حجم و تعداد نمونه(رنگ سبز)، پروتکل جداسازی توصیه شده(رنگ زرد)، استراتژی توالی‌یابی(رنگ آبی)

 

 

رفرنس

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24013102/